Составы, содержащие лектин, и их применение

(21), (22) Заявка: 99100724/14, 20.06.1997

(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 20.06.1997

(43) Дата публикации заявки: 10.12.2000

(45) Опубликовано: 20.04.2003

(56) Список документов, цитированных в отчете опоиске: DE А 4318307 (JONAS L.), 08.12.1994. US A 5053386 (TUNG Т.), 01.10.1991. ЛАХТИН В.М. Лектины и аспекты их изучения. Микробиологический журнал, №3, т.51, 1989, с.69-74. БОРОВСКАЯ Т.А. Лектины и изобретения. Вопросы их патентной защиты, выявления и оформления. Изучение и применение лектинов. Т.2, Лектины в биологии и медицине, с.80-85.

(85) Дата перевода заявки PCT на национальную фазу: 21.01.1999

(86) Заявка PCT: GB 97/01668 (20.06.1997)

(87) Публикация PCT: WO 97/49420 (31.12.1997)

Адрес для переписки: 190000, Санкт-Петербург, наб. Мойки, 58, ПРОЦЕСС ИНСАЙТ, пат.пов. М.И.Ниловой, рег.№ 378

(71) Заявитель(и): АЛИЗАЙМ ТЕРАПЕВТИКС ЛИМИТЕД (GB)

(72) Автор(ы): ПУШТАИ Арпад Януш (GB),

БАРДОШ Сюзанна Магдолна (GB),ПАЛМЕР Ричард Майкл Джон (GB),ФИШ Нейл Вильям (GB),КОТЕЛИС Гйорги Д. (HU)

(73) Патентообладатель(и):

АЛИЗАЙМ ТЕРАПЕВТИКС ЛИМИТЕД (GB)

(74) Патентный поверенный:

Нилова Мария Иннокентьевна

(54) СОСТАВЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ЛЕКТИН, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине. Предложен способ контроля пролиферации слизистых клеток, способ уменьшения и/или лечения повреждения, вызванного повреждающего клетки агентом, набор, содержащий лектин и цитопротектор и композиция, содержащая лектин и цитопротектор. Реализация изобретения осуществляется благодаря защитным свойствам лектинов в отношении клеток слизистой. 4 c. и 17 з.п. ф-лы, 17 табл., 5 ил.

Изобретение касается использования пектинов в производстве лекарств для контроля пролиферации слизистых клеток, для уменьшения и/или лечения повреждений, вызванных агентом, повреждающим клетки, и для уменьшения и/или лечения нарушений обмена веществ, а также касается композиций и диет, включающих пектин, их применения в медицине и других областях, и применения отходов соевых продуктов, в частности фракции соевой сыворотки, в производстве указанных лекарств и композиций.

Лектины представляют собой протеины или гликопротеины, обычно растительного или даже микробного или животного происхождения, которые распознают специфические гликоконъюгированные структуры и прикрепляются к ним. Перорально вводимые лектины, такие как лектин фасоли (Phaseolus vulgaris), фитогемагглютинин (ФГА), может быть мощными посторонними агентами роста кишечника крыс, вызывающими полностью обратимый, зависимый от полиамина, гиперпластический рост тонкого кишечника (Bardocz et al., 1992). Лектин активно связывается с щеточной каемкой и частично осуществляется его трансцитоз (Pusztai, 1991). В специфических дозах лектины, например, ФГА, повреждают стенку кишечника, вызывая чрезмерный рост кишечной палочки в просвете (Pusztai et al., 1993), увеличивая скорость мобилизации липидов и окисления глюкозы (Grant et al., 1987) и заметно снижая фракционную скорость синтеза протеинов в скелетной мускулатуре (Palmer et al., 1987; Bardocz et al., 1992). Таким образом, лектины, например ФГА, обычно считаются пищевыми токсинами, поскольку при высокой пороральной дозировке они вызывают серьезную потерю организмом липидов, гликогена и мышечного протеина (Pusztai, 1991), и, возможно, смерть.

Пороговые уровни безопасного, нетоксичного перорального приема лектина для человека и животных не известны.

Слизистыми клетками являются клетки, составляющие любую слизистую оболочку (влажную пленку, обволакивающую многие трубчатые структуры). Многочисленные клетки обеспечивают защитный слой между окружающей средой и внутренними органами животного. Примеры слизистых клеток включают эпителиальные клетки кожи, оболочку пищеварительного тракта, ткань, покрывающую глаз, и оболочку легких и носа. Известно множество расстройств слизистых клеток, включая состояния, когда слизистые клетки повреждаются, или защитный наружный слой, такой как слизистый, отсутствует. Состояния, связанные с ненормальной регуляцией пролиферации слизистых клеток, могут включать рак кожи, псориаз, синдром раздражения кишечника, воспалительные заболевания кишечника и воспаление слизистых оболочек. Воспаление слизистых оболочек является болезненным и ослабляющим состоянием, при котором быстро растущие эпителиальные и слизистые клетки повреждаются, и наружный слизистый слой удаляется и/или не замещается достаточно быстро. Воспаление слизистых оболочек может привести к инфекции, вызываемой микроорганизмами, присутствующими, например, во рту или в кишечнике. Это состояние, очевидно, является основным побочным эффектом при лечении рака. Сфера действия и тяжесть воспаления слизистых оболочек могут возрасти с увеличением числа циклов терапии рака и могут в конечном счете повлиять на эффективность лечения пациента и его выживание.

Агенты, которые повреждают слизистые (и другие) клетки и могут вызывать воспаление слизистых оболочек, включают химиотерапевтические агенты, радиотерапию, химикаты (органические или неорганические), токсины, кислоты, щелочи, любой источник радиации и свободные радикалы. Химиотерапия и радиотерапия, используемые по отдельности, совместно или в сочетании с хирургическими методами, являются основными терапевтическими подходами для лечения рака. При химиотерапии можно использовать цитототоксический агент для непосредственного повреждения ДНК определенных клеток. При введении достаточной дозы цитотоксического агента в нужную ткань, т.е. в опухоль, неправильное восстановление ДНК может привести к накоплению мутаций в ДНК, повреждениям и хромосомным отклонениям, которые в конечном счете приводят к гибели клетки. При радиотерапии используют радиацию либо для непосредственного повреждения ДНК нужной клетки, либо для использования потенциала ионизирующего излучения для получения свободных радикалов, способных разрушить спирали ДНК (Steel, 1996).

Принцип использования химиотерапии для лечения рака заключается в том, что цитотоксическое лекарство вводят для подавления деления клетки, что в конечном счете может привести к гибели клетки. Поскольку раковые клетки обычно растут быстрее, чем нормальная ткань, ожидается, что цитотоксическое лекарство уничтожит больше раковых клеток, чем нормальных клеток. Однако, в отличие от радиотерапии, цитотоксические лекарства дают таким образом, что они систематически воздействуют на весь организм. Серьезные побочные эффекты, например токсичность в отношении жизненно важных тканей, включая костный мозг, могут ограничивать дозу цитотоксического лекарства, которую можно вводить пациенту без летального исхода. Аналогично, при использовании излучения для лечения рака не делается различия между раковой и нормальной тканью. Использование радиотерапии поэтому является компромиссным решением в попытке вызвать наибольшие повреждения раковых клеток путем нацеливания излучения без нанесения непоправимых повреждений нормальной ткани.

Для лечения рака разработано и внедрено много цитотоксических лекарств. Основной принцип действия этих лекарств заключается в том, что они создают препятствия или ингибируют ключевые стадии процесса деления клетки. Основные классы лекарств воздействуют на репликацию ДНК, ремонт ДНК, разделение хромосом или на разделение цитоплазмы. Огромное большинство цитотоксических лекарств препятствуют синтезу и репликации ДНК. Одним из наиболее широко используемых цитотоксических лекарств этого класса является 5-фторурацил (5-ФУ). Активность 5-ФУ может быть также изменена добавлением восстановленных фолатов, таких как лейковорин кальция (Isacoff et al., 1994). Известны другие цитотоксические лекарства, ингибирующие синтез и репликацию ДНК, направленные на различные деоксирибонуклеотиды, используемые при получении ДНК, например цитарабин. Нити ДНК, содержащие цитарабин, непосредственно ингибируют активность ДНК-полимеразы (Archimund & Thomas, 1994).

Второй основной класс цитотоксических лекарств составляют лекарства, непосредственно вызывающие разрыв нитей ДНК, или ингибирующие ремонт разрывов ДНК. Циклофосфамид является примером лекарства, которое может непосредственно вызвать разрыв нитей ДНК (Sparano & Wernik, 1994). Третий основной класс составляют лекарства, которые фактически препятствуют сборке и разборке тубулина, таким образом непосредственно ингибируя митоз и деление клеток. Таксаны, такие как паклитаксел и досетаксел, являются лекарствами, которые полимеризуют тубулин в стабильные микротрубчатые пакеты. Синтетические винка-алкалоиды, такие как винорелбин, являются ядами для веретенообразных клеток и проявляют свое противоопухолевое действие так, что они препятствуют сборке тубулина в микротрубки (Dieras & Pouillart, 1995).

В практике современной радиотерапии для лечения рака используют ряд источников излучения. Наиболее часто используют такие источники, как источники рентгеновских лучей, гамма-лучей, протонов или нейтронов из - или -излучателей. На практике непрерывная радиотерапия с низкими дозами в течение нескольких дней дает наилучшие шансы для различного воздействия на нормальную и раковую ткань. Однако эта методика ограничена использованием радиоизотопов, эффективных лишь по отношению к некоторым типам опухолей, например раку щитовидной железы. В клинических условиях большинство методик радиотерапии используют высокие дозы радиации, направляемой в виде луча на раковую ткань. Облучение нормальной ткани по возможности снижают за счет использования свинцовой защиты или путем поворачивания пациента так, что нормальная ткань получает меньшую дозу, чем раковые клетки. Хотя такой подход и может быть эффективным, его использование может быть ограничено суммарной экспозицией нормальной ткани радиацией и сопротивляемостью многих опухолей высоким дозам радиации.

Хорошо известно, что отдельные цитотоксические агенты или источники излучения могут быть более подходящими для определенных типов рака. Например, Cisplatin широко используют при раке яичек, таксаны более подходят при раке груди, а 5-ФУ широко используют при раке кишечника и прямой кишки. Однако терапия одним агентом редко обеспечивает полное излечение рака, а процент выживания все еще низок. Некоторые усовершенствования проведены при использовании режимов лечения несколькими лекарствами (Au et al., 1996).

Разработано несколько соединений, способных сенсибилизировать раковые клетки по отношению к воздействию радиации и химиотерапии (что снижает повреждения нормальной ткани). Однако использование радиосенсибилизаторов, таких как миметики витамина К - Синкавит и Менадион, а также протекторов, таких как сульфидрилсодержащие соединения - цистеин, цистеамин и Этиол - также оказались неэффективным (Denekamp, 1996).

Хотя химиотерапия и радиотерапия являются наиболее широко используемыми видами лечения рака, процент выживания ограничен рядом факторов. Ключевым фактором является то, что цитотоксическое лекарство или радиация не различают нормальную и раковую ткани. В большинстве случаев невозможно дать достаточную дозу цитотоксического лекарства или радиации, чтобы надежно уничтожить все раковые ткани, так как это могло бы стать фатальным для пациента. Общеизвестными побочными эффектами известных режимов лечения являются потеря волос, поражение костного мозга, тошнота, рвота, диаррея (Paulsen et al., 1996). Кроме того, существует много случаев, когда использование радиотерапии, особенно в тазовой области, приводит к изменению желудочно-кишечной функции, (Yeoh et al., 1993) и долговременному повреждению кишечника, требующему хирургического вмешательства (van Halteren et al., 1993).

Основной прорыв был сделан в последние 10 лет в связи с получением гематопоэтиков - факторов роста. Теперь возможно давать более высокие дозы цитотоксических лекарств и радиации, а затем спасти ткани, такие как костный мозг и белые кровяные тельца, путем введения рекомбинантных агентов роста, таких как фактор, стимулирующий колонию гранулоцитов-макрофагов (Erkisis et al., 1996). Такой подход обеспечил улучшенный прогноз и достижение более высоких процентов выживания. Хотя факторы роста, специфичные для эпидермы, такие как фактор роста эпидермы, известны, сложная природа регулирования роста кишечника затрудняет выработку эффективных "спасательных" процедур для кишечника (Podolsky, 1993). Поскольку в настоящее время такого фактора роста для кишечника не существует, повреждения желудочно-кишечного тракта цитотоксическими лекарствами и радиацией лимитируют их дозировку.

В данном изобретении использованы свойства защиты тканей и метаболические эффекты низких дозировок пектина для защиты и восстановления биологического материала, поврежденного радиотерапией и/или химиотерапией. Данное изобретение представляет особый интерес из-за выраженного профилактического эффекта композиций пектина (положительный фактор роста) перед лечением, таким как радиотерапия и/или химиотерапия.

Нарушения обмена веществ включают любое нарушение, связанное с обменом веществ в организме или являющееся его следствием, в частности, ожирение и нарушения, связанные с ожирением, такие как гипергликемия (диабет II типа), сердечно-сосудистые заболевания, паралич, желудочно-кишечные заболевания и связанные с ними состояния. Нарушение обмена веществ может потребовать контроля пролиферации слизистых клеток или же контроль пролиферации слизистых клеток может быть независимым от нарушения обмена веществ.

Известно, что высокие дозы пектинов могут нанести ущерб обмену веществ животного. Например, высокие дозы лектинов могут повреждать тимус, вызывать гипертрофию поджелудочной железы и чрезмерный рост кишечной палочки, приводящий к плохому питанию и росту. В данном изобретении впервые описаны позитивные эффекты в обмене веществ при пероральном введении низких доз лектинов. К удивлению, было обнаружено, что введение низких доз пектина приводит к снижению содержания жира в организме, что может быть использовано для лечения ожирения и для снижения массы тела, не вызываемого медицинскими средствами.

Использование сои в питании человека возрастает, и протеины сои часто служат источником диетического протеина в питании живых организмов. К сожалению, поскольку соя содержит немало антиподов питательных веществ, главным образом лектинов и ингибиторов трипсина, эффективность питательного использования диет, содержащих соевые продукты, ниже, чем ожидается исходя из химического состава (Gupta, 1987), особенно при их длительном использовании (Grant et al., 1986). Общепринятой является точка зрения, что соевые продукты можно было бы шире использовать в диетах питания людей и животных, если бы удалось снизить их антипитательные эффекты.

Содержащиеся антипитательные вещества из большинства соевых продуктов обычно удаляют путем, основанным на различных видах тепловой обработки (Liener, 1994). Однако большинство этих способов являются дорогостоящими и могут привести к потерям важных аминокислот и образованию токсичных побочных продуктов. Хотя могут быть разработаны и более дешевые и эффективные способы тепловой обработки, другие возможности снижения антипитательных эффектов соевых продуктов включают регулирование диеты и создание новых стратегий питания. Получение соевых продуктов, в частности мало используемой сывороточной фракции, свободных от основных отрицательных эффектов антиподов питательных веществ, могло бы принести значительный экономический эффект в пищевой промышленности и животноводстве.

В данном изобретении предложены диета и диетическая стратегия для максимизации выгодных метаболических эффектов пектина. В частности, соевые фракции могут быть использованы так, что негативные эффекты антипитательных фракций будут снижены. Кроме того, преимущества низкой дозировки лектина могут быть использованы для улучшения усвоения питательных веществ из бедных такими веществами фракций сои.

Соответственно, данное изобретение предлагает в качестве первого аспекта применение лектина в производстве лекарства для контроля пролиферации слизистых клеток. Контроль пролиферации слизистых клеток включает уменьшение и/или лечение любых повреждений слизистых клеток и/или тканей. В данной заявке "уменьшение" означает любой эффект, который уменьшает любое повреждение или любое медицинское нарушение, в любой степени, включая предупреждение. В данной заявке "лечение" означает любое облегчение расстройства, заболевания, синдрома, состояния, боли или сочетания двух или более из них.

В частности, первый аспект изобретения касается контроля пролиферации слизистых клеток при уменьшении и/или лечении микоза, и/или повреждений кишечника.

Контроль пролиферации слизистых клеток особенно полезен при уменьшении и/или лечении повреждений, вызванных повреждающим клетки агентом. Обычно повреждающие клетки агенты во всех аспектах данного изобретения включают радиотерапию, химиотерапию или их сочетание. В данной заявке термины "облучение" и "радиотерапия" имеют одинаковый смысл, имея в виду источник излучения, который может быть использован или не использован в качестве терапевтического средства.

Первый аспект данного изобретения особенно эффективен при контроле пролиферации слизистых клеток перед, в течение или после радиотерапии, химиотерапии или их сочетания. Изобретение осуществляется благодаря защитным и восстановительным свойствам лектинов.

Слизистые клетки - это клетки, составляющие любую слизистую оболочку (влажная оболочка, выстилающая многие трубчатые структуры и полости). Многие из них обеспечивают защитный слой между внешним окружением и внутренними органами живого организма. Слизистые клетки/ткани включают клетки носовых пазух, дыхательных путей, кожи, желудочно-кишечного тракта, а также систем печени и поджелудочной железы. Поверхность полости рта также выстлана слизистой оболочкой. Слизистая оболочка состоит из поверхностного слоя эпителия, который содержит железы, выделяющие слизь, а также нижележащих слоев соединительной ткани и мышечной слизи, которая образует внутреннюю границу слизистой оболочки.

Применение лектина для контроля пролиферации слизистых клеток особенно полезно в отношении клеток желудочно-кишечного тракта, Контроль может быть осуществлен для увеличения функционирования и/или длины желудочно-кишечного тракта или для контроля природы и/или плотности поверхностных гликопротеинов, выделяемых клетками желудочно-кишечного тракта. Другие виды применения в отношении контроля пролиферации слизистых клеток включают уменьшение и/или лечение расстройств кишечника, таких как воспалительные заболевания кишечника и синдром раздражения кишечника, а также уменьшение и/или лечение поражений кишечника, и восстановление и замещение слизистых клеток перед, в течение или после радиотерапии, химиотерапии или сочетания двух или более из них.

Использование этих вариантов контроля включает:

а) пролиферацию клеток кишечника, которая приводит к увеличению функциональной площади и длины кишечника, что может быть полезной терапией при повреждении функции кишечника, например, вследствие хирургической операции или несчастного случая, и/или б) контроль скорости обновления клеток кишечника, что может обеспечить контроль природы и плотности выделяемых поверхностных гликоконъюгатов, что становится все сложнее по мере старения клеток. Поскольку гликоконъюгаты оказывают влияние на некоторые свойства кишечника, в частности на расположенность к внедрению бактерий, введение лектина можно предложить как терапевтический или профилактический контроль этих свойств.

В частности, контроль пролиферации клеток можно использовать для повышения питающей способности тонкого кишечника и/или контроля выделений гликоконъюгатов клетками кишечника. Такие эффекты не обязательно являются медицинскими расстройствами и могут быть лишь косметическими или функциональными, выше или ниже приемлемого медицинского уровня.

В соответствии со вторым аспектом изобретения предложено применение лектина в производстве лекарства для уменьшения и/или лечения повреждений, вызванных агентом, повреждающим клетки. К агентам, повреждающим клетки, относится радиотерапия, химиотерапия или их сочетание, к повреждениям относятся, в частности, поражения кишечника и/или воспаление слизистой оболочки.

Для первого и второго аспектов изобретения источники радиотерапии включают, не ограничиваясь ими, источники рентгеновского излучения, гамма-излучения, протонов и нейтронов, - или - излучений, или сочетания двух или более из них. Радиотерапия может быть использована в сочетании с химиотерапией, использующей цитотоксический агент, такой как метотрексат, Cisplatin и/или 5-фторурацил, а также в сочетании с хирургическими процедурами.

Для первого и второго аспектов изобретения химиотерапевтические агенты включают любой цитотоксический агент и, не ограничиваясь ими, такие агенты, как 5-фторурацил, Cisplatin, доксорубицин, метотрексат, таксол или сочетание двух или более из них. как указано выше, один или более химиотерапевтический агент может быть использован в сочетании с радиотерапией и/или хирургическими процедурами.

Изобретение особенно хорошо применимо для уменьшения и/или лечения повреждений тканей млекопитающих, в частности тканей человека. Изобретение особенно важно для тканей человека ввиду значительного применения радиотерапии и/или химиотерапии при лечении рака. Однако данное изобретение также можно применять в ветеринарии, в частности, для животных на ферме и домашних животных.

Первый аспект изобретения касается всех слизистых клеток и/или тканей и включает слизистые клетки и ткани в целостном организме, а также вне целостного организма, включая отдельные слизистые клетки и ткани. Второй аспект изобретения касается всей биологической материи, включая целостные организмы и их части, и включает отдельные органы и отдельные ткани, включая слизистые клетки и ткани, изобретение также касается материи, подвергнутой, преднамеренно или непреднамеренно, воздействию любого агента, повреждающего клетки.

Изобретение особенно применимо к биологической материи, особенно чувствительной к агентам, повреждающими клетки, таким как радиотерапия и/или химиотерапевтические агенты. Такая биологическая материя, согласно первому аспекту изобретения, включает слизистые оболочки кишечника, полости рта, носовых проходов, пищевода, желудка, легких, тонкого кишечника, толстого кишечника (включая ободочную кишку и прямую кишку), эпителиальную ткань (например, покрывающую глаз), а также любые другие слизистые клетки и/или ткань. Такая биологическая материя, в соответствии с вторым объектом изобретения, включает все слизистые клетки и ткани, указанные выше, а также костный мозг, селезенку, все кроветворные клетки, кровяную ткань, тимус, волосообразующую ткань, глазную ткань и ткань яичек/простаты. Чувствительность кишечника к повреждениям агентом, повреждающим клетки, связана с состоянием обмена веществ. Именно действие агента роста пектинов, в частности, на кишечник (особенно на тонкий кишечник), очевидно, является важным для профилактического и/или терапевтического действия перед введением агентов, повреждающих клетки, или в течение него.

Лектины можно разделить на классы "токсичных" и "нетоксичных". Токсичные лектины включают или могут быть классифицированы как рибосоминактивирующие протеины (РИП) типа 2. Это гибридные молекулы, которые содержат токсичную группировку (А), которая после внедрения в клетку необратимо ингибирует синтез протеинов, и лектиновую группировку (В), которая ускоряет внедрение РИП в клетку. РИП типа 2, такие как рицин, являются одними из наиболее ядовитых веществ, известных людям, с потенциальными величинами LD50, достигающими 0,1 г на кг массы тела. Они могут наносить необратимые повреждения млекопитающим при длительном приеме, в конечном счете приводя к смерти.

Связывание лектинов с клетками может происходить по-разному. Некоторые связываются слабо, а другие - очень прочно. Прочное связывание соответствует лектину, для которого при пероральном введении крысам 10 мг свыше 75% (и до 100%) связывается с кишечником. Лектин фасоли представляет собой прочно связывающийся лектин. В некоторых случаях прочное связывание может привести к токсичности, и такие лектины можно назвать токсичными. Лектины по данному изобретению включают лектины, которые либо встречаются в природных композициях, или их выделяют оттуда (в любой степени), либо химически синтезированные лектины, модифицированные лектины или производные этих лектинов (природных или синтетических). Производные лектинов включают одну или более группировку из лектина, содержащего несколько группировок. Известные способы получения лектинов включают очистку лектинов, полученных из природных источников (Pusztai & Palmer, 1977; Carvalho, 1993) и лектинов, полученных биотехнологическим путем, например, как описано в патенте США 4889842.

Любой лектин можно применять в соответствии с первым аспектом изобретения. Известно много лектинов. Широко используемым способом характеризации лектинов является их специфичность связывания с углеводами. Множество специфических групп связывания углеводов включают N-ацетил-D-галактозамин, -D-маннозу, -L-фукозу, бета-лактозу, галактозил-бета-(1-3)-N-ацетил-D-галактозамин, D-глюкозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилнейраминовую кислоту. Некоторые пектины попадают более чем в одну специфическую группу связывания углеводов. Особенно интересными для данного изобретения являются пектины, полученные из фасоли, соевых бобов, канавалии мечевидной, зерен пшеницы, семян лотоса, лука, чечевицы, томата, картофеля и сочетания двух или более из них.

Поскольку лектины являются протеинами, они явно подвержены дестабилизации/денатурации при воздействии многих параметров, таких как нагревание, кислоты, щелочи и т.п. Некоторые лектины более стойки к действию этих факторов, чем другие. Так как при использовании лектинов в данном изобретении (во всех отношениях) требуются их свойства белков, важно, чтобы лектины не были полностью уничтожены или денатурированы перед их использованием или в течение него (например, в сильно кислой среде желудка или в слабощелочной среде нижней части кишечника). Соответственно, для лектинов, используемых в данном изобретении, может сначала потребоваться охарактеризовать их в отношении того, как они могут измениться при переработке и/или введении. Такая характеристика является стандартной методикой, и ее легко может провести любой специалист. Концентрация лектина, требуемого для любого из аспектов изобретения, меняется при любой денатурации или дестабилизации лектина.

Концентрации лектинов, описываемых в данной заявке, зависят от их природных свойств, если не происходит снижения их активности путем денатурации или дестабилизации. Так, концентрации вводимых лектинов не являются абсолютными, а зависят от активности лектина. Соответственно, композиция, которая, например, содержит лектин с уменьшенной наполовину активностью, но в концентрации вдвое выше, является такой же, как композиция, содержащая половинное количество, но при отсутствии изменений его активности. Кроме того, активность любого лектина может быть увеличена путем модификации, например, при рекомбинантном получении и/или путем получения усеченных мутантов с увеличенной активностью. Те же подходы к соотношению концентрации и активности лектина применимы также к лектинам с повышенной активностью. Все модифицированные лектины охватываются в данном изобретении, включая лектины с повышенной или пониженной активностью, и включают, например, мономерный усеченный лектин с полной или модифицированной активностью.

Лектины согласно данному изобретению являются тканевыми протекторами.

Первый и второй аспекты изобретения касаются производства лекарств, конкретные дозировки которых должен окончательно определить лечащий врач, принимая во внимание такие факторы, как используемые лектин или лектины, вид живого организма, его возраст, массу, сложность симптомов и/или сложность применяемого или предписанного лечения, способ введения композиции, отрицательные реакции и другие противопоказания. Уровень конкретно назначаемой дозировки может быть определен стандартными клиническими методами с полным контролем за прогрессом и выздоровлением пациента. В таких методах могут быть использованы возрастающие дозировки, при которых в качестве исходной дозы для человека используют небольшой процент максимально переносимой дозы для животного. Предварительные данные для уровней дозировки могут быть взяты из результатов, приведенных в экспериментальной части данной заявки и исходя из следующих уровней, экстраполированных для человека.

Представляется, что подходящим верхним пределом является концентрация лектина примерно до 0,3 г на кг массы тела в день. Концентрация 0,3 г на кг массы тела в день может привести к расстройству желудочно-кишечного тракта пациента, однако эти симптомы могут быть приемлемыми, поскольку пациент получает более высокие шансы на выживание при таких заболеваниях, как рак. Представляется, что подходящим нижним пределом является концентрация лектина примерно 0,0001 мг (0,1 мкг) на кг массы тела в день. Предпочтительные промежуточные дозировочные концентрации включают содержание лектина примерно до 0,2 г, 0,15 г и 0,05 г на кг массы тела в день, а затем концентрации примерно 1 мг, 0,5 мг, 0,01 мг и 0,005 мг на кг массы тела в день. Любая из этих концентраций может быть использована в качестве верхнего и/или нижнего предела, что обеспечивает множество приемлемых уровней концентрации. Что касается концентраций вводимого лектина при использовании не для получения терапевтического и/или профилактического эффекта, дозировка лектина может быть слегка повышена.

Для любого аспекта данного изобретения могут быть использованы лекарства, обеспечивающие требуемую концентрацию лектина за один или более "приемов" в день ("прием" означает любую форму введения). Некоторым аспектам изобретения может удовлетворять однократный прием высокой концентрации лектина, а другим может удовлетворять несколько приемов, равномерно или неравномерно распределенных в один и тот же период времени, но с более низкой концентрацией лектина за прием или с разделением дозировки.

Применение лектина в производстве любого лекарства согласно данному изобретению может происходить в сочетании с подходящим фармацевтическим носителем и/или эксципиентом. Такие носители и эксципиенты хорошо известны (например, Handbook of Pharmaceutical excipients (1994), 2nd Adition, Eds. A. Wade /P. J. Weller, The Pharmaceutical Press, American Pharmaceutical Association). Особенно пригодными, согласно данному изобретению, являются композиции и/или медикаменты, предназначенные для системы введения лекарств в ободочную кишку, или в виде капсулы.

Первый и второй аспекты изобретения также включают использование лектина в сочетании с цитопротектором. Цитопротектором предпочтительно является радиосенсибилизатор, хемопротектор (включая разнообразные ловушки), фактор роста, или сочетание двух или более из них. Из указанных цитопротекторов предпочтительны следующие: радиосенсибилизаторы - миметик витамина К, такой как Синкавит или Менадион; гадолиния тексафирин или иобенгуан (([[3-иод-13311)фенил] метил]гуанидин); хемопротекторы - Sulcraphate, цистеин, цистеамин, Ethyol, балазипон или досмальфат; ловушки свободных радикалов - WR 3689 (2-[[3-метиламино)пропил] амино] этантиола дигидрофосфат, AD 20 (2-[[2-метоксифенил)ацетил] амино] -2-пропионовая кислота или нитроксидный антиоксидант; факторы роста - фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (G-CSF), фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), эритропоэтин (ЕРО), фактор роста эпидермы (EGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), трансформирующий фактор роста (TGF и ), любой интерлейкин, включая IL-11 и IL-15, инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста из тромбоцитов (PDGR), Bombesin, Relaxin, Calcitonin, фактор роста из молозива (CDGF), амлексанокс или амоксанокс, протегрин, пилокарпина гидрохлорид, фактор клеток стебля (STF), тромбопоэтин, steel-фактор (SF), любой интерферон, включая -интерферон, или любой цитокин.

Помимо цитопротекторов лекарство может включать одно или более другое фармацевтическое соединение/агент. В частности, могут быть включены антимикробные агенты. Такие агенты могут быть включены для борьбы с инфекциями, в частности вторичными инфекциями, связанными с воспалением слизистых оболочек, воспалительными заболеваниями кишечника, синдрома раздражения кишечника и т.д.

Лекарства, полученные согласно любому из аспектов изобретения, предпочтительно вводят перорально или ректально (в зависимости от доступа к одной или более части пищеварительного тракта), хотя можно также использовать парэнтеральное введение лекарства.

Третьим аспектом изобретения является применение лектина в производстве лекарства для уменьшения и/или лечения расстройств обмена веществ. К третьему аспекту изобретения также относится применение лектина в производстве лекарства для достижения потери/уменьшения веса. Такая потеря/уменьшение веса необязательно связана с медицинским состоянием (например, нарушением обмена веществ) и может быть чисто косметической потерей/уменьшением веса. Лектином может быть любой лектин согласно изобретению, наиболее предпочтительно, выделенный из соевых бобов или фасоли.

Нарушения обмена веществ включают любое нарушение, связанное с обменом веществ в организме и/или являющееся его результатом, в частности с ожирением и расстройствами, вызванными ожирением, такими как гипергликемия (диабет II типа), сердечно-сосудистые нарушения, паралич, желудочно-кишечные расстройства и состояния, связанные с желудочно-кишечными расстройствами. Нарушения обмена веществ могут потребовать контроля пролиферации слизистых клеток, или контроль пролиферации слизистых клеток может быть независимым от нарушений обмена веществ.

Все соответствующие признаки первого и второго аспектов изобретения относятся также и к третьему.

Чем выше концентрация пектина, тем быстрее может произойти предотвращение или лечение нарушения обмена веществ. Однако, как обсуждается здесь, на предпочтительную концентрацию дозировки лектина могут повлиять многие факторы.

В соответствии с четвертым аспектом изобретения, предложена композиция, включающая лектин, применяемая для контроля пролиферации слизистых клеток, уменьшения и/или лечения нарушений обмена веществ, или сочетания двух или более из них. Этот аспект изобретения применим, в частности, к лектинам, медицинское применение которых ранее не было известно. Соответствующие признаки первого, второго и третьего аспектов изобретения также касаются четвертого аспекта изобретения.

В соответствии с пятым аспектом изобретения предложена композиция, включающая лектин и цитопротектор. Такой аспект изобретения может касаться первого и/или второго аспекта изобретения, так как это может быть один вариант выполнения лекарства, полученного в соответствии с первым или вторым аспектами изобретения. Соответственно, подходящие признаки первого и второго аспектов изобретения, описанные выше, также касаются пятого аспекта изобретения. Особенно предпочтительной является композиция, в которой лектин по меньшей мере частично очищен или выделен.

Композиция согласно пятому аспекту изобретения может представлять собой смешанный препарат для введения, или может быть комбинированным препаратом для одновременного, раздельного или последовательного применения (или введения). В случае комбинированного препарата сначала вводят либо лектин, либо цитопротекторную часть композиции.

Пятый аспект изобретения особенно подходит для применения при уменьшении или лечении повреждений, вызванных повреждающим клетки агентом, в частности, облучением и/или химиотерапией. Соответственно, может потребоваться включить в композицию фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или носители, как описано в отношении первого и второго аспектов изобретения. Кроме того, композиция, так же как в первом и втором аспекте изобретения, наиболее эффективна по отношению к биологической материи, наиболее чувствительной к действию повреждающих клетки агентов, в частности облучения и химиотерапии.

Все соответствующие признаки аспектов с первого по четвертый данного изобретения также применимы к пятому аспекту.

Шестой аспект изобретения относится к способу получения композиции согласно пятому аспекту изобретения. Этот способ может включать смешивание лектина и цитопротектора, возможно, в сочетании с одним или более ингредиентом, таким как дополнительные цитопротекторы, антимикробные агенты и/или фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или носители. В альтернативном варианте для композиции, содержащей разные компоненты, вводимые одновременно, раздельно или последовательно, готовят индивидуальные компоненты, которые могут находиться в сочетании с другими ингредиентами, включая фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или носители.

В седьмом аспекте изобретения предложен способ контроля пролиферации слизистых клеток в соответствии с первым аспектом изобретения, уменьшения и/или лечения повреждений, вызванных повреждающим клетки агентом, согласно второму аспекту изобретения, а также для уменьшения и/или лечения нарушений обмена веществ (включая соответствующие признаки) в соответствии с третьим аспектом изобретения. Соответствующие признаки аспектов с первого по шестой также применимы к седьмому аспекту изобретения. Способ включает прием общей диетической концентрации лектина до 0,3 г, более предпочтительно 0,2 г на кг массы тела в день. Лектином также может быть любой из описанных выше лектинов, предпочтительно выделенный из соевых бобов или фасоли (ФГА).

Для всех терапевтических (отдельных) аспектов изобретения (т.е. когда лектин применяют лишь после какого-либо лечения, повреждающего клетки агента и т.п.), предпочтительной дозой лектина является доза менее 0,2 г на кг массы тела.

Согласно восьмому аспекту изобретения, предложена диета, включающая прием лектина в течение периода времени от 2 до 5 дней или в течение неограниченного (длительного) времени. Соответствующие признаки аспектов изобретения с первого по седьмой также применимы к восьмому аспекту. Лектин может быть любым из описанных выше согласно первому аспекту изобретения, наиболее предпочтительно лектин, полученный из соевых бобов или соевой сыворотки.

Диета в соответствии с восьмым аспектом изобретения предпочтительно включает общее содержание лектина до 0,3 г, предпочтительно 0,2 г на кг массы тела в день. Кроме того, предложено дополнение к диете, которое доводит общий диетический прием лектина до концентрации 0,3 г, предпочтительно 0,2 г на кг массы тела в день. Лектин может представлять собой любой, или сочетание двух или более из них (из описанных выше), в соответствии с первым аспектом изобретения. Предпочтительно лектин для данной диеты получен из соевых бобов или фасоли (ФГА). Такая диета или дополнение к диете полезна при контроле пролиферации слизистых клеток в соответствии с первым аспектом изобретения, для уменьшения и/или лечения повреждений, вызванных повреждающим клетки агентом, согласно второму аспекту изобретения, для уменьшения и/или лечения нарушений обмена веществ согласно третьему аспекту изобретения, или для сочетания двух или более из них. Диета и/или дополнение к диете может также применяться при потере/уменьшении веса, не связанного с лечением.

Диета и/или дополнение к диете применима к любому живому организму, включая человека.

Диета согласно восьмому аспекту изобретения особенно полезна, если после нее следует период приема диеты высокого качества. Высококачественной диетой согласно данному изобретению можно назвать диету, включающую все жизненно важные белки, жиры, углеводы, минеральные соли и витамины, необходимые для нормального роста живого организма. Жизненно важные компоненты высококачественной диеты предпочтительно содержатся в оптимальном соотношении. Высококачественная диета не должна содержать каких-либо компонентов, которые замедляют или ингибируют рост и развитие живого организма.

Предпочтительным свойством высококачественной диеты является положительное преобразование съеденной пищи в массу тела.

Предпочтительно высококачественная диета следует непосредственно или вскоре после (до 2 дней) лектиновой диеты согласно восьмому аспекту изобретения. Высококачественная диета наиболее полезна в течение периода времени до 7 дней, предпочтительно в течение периода времени до 5 дней. Эта диета может также быть предпочтительна для применения при длительном (более месяца, предпочтительно более года) лечении нарушений обмена веществ и косметической потере веса.

При использовании в сочетании с повреждающим клетки агентом (хотя необязательно при одновременном приеме), пектиновую питательную часть диеты оптимально ограничить периодом до 5 дней, поскольку 48-72 часа часто бывает достаточно для завершения полного цикла превращения в кишечнике, тем самым достигается преимущество более высокой скорости абсорбции питательных веществ и их использования в части цикла, связанной с контролем питания, часть цикла, связанная с высококачественным питанием, оптимально ограничить 5 днями для получения максимального улучшения эффективности превращения пищи.

Предпочтительно диету, включающую период кормления пектином с последующим периодом питания высококачественной диетой повторяют по меньшей мере дважды для получения циклической диеты. Циклы можно повторять до 20 раз, предпочтительно до 10 раз, наиболее предпочтительно до 6 раз.

Описанная диета обеспечивает временное увеличение эффективности приема питательных веществ, обусловленное введением лектина. Поэтому чередованием диет, содержащих и не содержащих лектин, можно осуществить улучшение состояний, зависящих от питания. Например, путем соответствующего расчета времени приема диет атлет может оптимизировать выступления на основных соревнованиях.

Диета согласно восьмому аспекту изобретения особенно полезна перед применением способа лечения облучением и/или химиотерапией или после такого применения. В таких случаях эта диета может быть даже более эффективной при использовании в сочетании с цитопротектором, таким как описанный для первого и второго аспектов изобретения.

В соответствии с девятым аспектом изобретения предложено применение отходов соевых продуктов, включая фракцию соевой сыворотки, в любом аспекте или связанном с ним аспекте изобретения. Применение таких отходов соевых продуктов снижает требования к удалению лектинов из соевых продуктов перед их использованием в качестве продуктов питания и позволяет эффективно использовать малоценные отходы соевых продуктов.

Далее изобретение будет проиллюстрировано несколькими неограничивающими примерами. Примеры приведены со ссылками на соответствующие чертежи.

На фиг. 1 показана чистая масса тела у крыс, которым скармливали диету, содержащую разные количества фитогемагглютинина в течение 10 дней (опыты 1а, b, с). На фиг.1а представлена зависимость чистой массы тела от мг ФГА/день, а на фиг. 1b - зависимость относительно чистого веса тела от log10 (мг ФГА/день) (О - опыт 1а; - опыт 1b; - опыт 1с).

На фиг.2 показан рост крыс, которым скармливали соево-альбуминную диету с последующей лактальбуминной диетой повторяющимися циклами, по сравнению с ростом пары крыс, которым в ходе опыта скармливали контрольную диету. Также показано время переключения крыс на различные диеты и приемы пищи.

На фиг.3 показано влияние введения 5-ФУ и ФГА на вес живого организма.

На фиг.4 показано влияние введения 5-ФУ и ФГА на ежедневный прием пищи.

На фиг. 5 показано влияние лектинсодержащей диеты на выживание животных через 30 дней после получения дозы радиации 6,75 Грэй (Gy).

ПРИМЕРЫ.

Материалы и методики

Очистка ФГА Для примеров, связанных с лечением ожирения и химиотерапией, ФГА очищали аффинной хроматографией на Sepharose 48-fetuin с использованием метода Pusztai & Palmer (1997) с некоторыми усовершенствованиями (Calvalho, 1993). Фасоль экстрагировали 0,05 М натрий-боратным буфером (рН 8,0) и разделяли на глобулины и альбумины путем диализа с помощью 0,033 М натрий-ацетатного буфера рН 5,0. Фракции ФГА Е-типа (эритроагглютинирующего) адсорбировали на Sepharose 48-fetuin при рН 7,6 (0,05 M Tris-HCI) и десорбировали с помощью 0,05 М глицин-НСl буфера, рН 3,0, также содержащего 0,5 М NaCI, с последующим диализом и сушкой вымораживанием. Для очистки ФГА L-типа (лимфоагглютинирующего), после удаления небольших количеств ФГА Е-типа из альбумина с помощью Sepharose 4B-fetuin, неадсорбированную фракцию фракционировали на сульфопропил-катионообменной ГПХ колонке (TSK SP-5PW, 21,5 мм х 150 мм; Anachem GB Ltd) в 0,005 М буфере, состоящем из ацетата натрия и уксусной кислоты, рН 3,8, содержащем 0,1 М NaCI, и элюировали с заданным градиентом увеличения ионной силы (0,1-0,5 М NaCl). В заключение удаляли низкомолекулярные примеси путем хроматографии на Sephadex G-100, и выделяли чистый ФГА L-типа после диализа и сушки вымораживанием. Выход: 0,32 г и 0,61 г Е-типа и L-типа ФГА, соответственно, на 100 г фасолевой муки.

Для примера, касающегося радиотерапии, ФГА выделяли путем размола 50 г фасоли в измельчителе с ситом, имеющим размеры ячеек 1 мм. Добавили 500 мл 0,02 М уксусной кислоты, содержащей 0,1 г аскорбиновой кислоты, и перемешивали 30 минут при комнатной температуре. Величину рН доводили до 5,0 с помощью 1М NaOH, и раствор перемешивали еще 2 часа при комнатной температуре. Раствор оставляли стоять при 4oС в течение ночи, а затем центрифугировали при 9000 об/мин в течение 15 мин. В поверхностный слой добавили 0,075 г CaCl2 и довели рН до 9,0 1М раствором NaOH. Поверхностный слой вновь оставили стоять при 4oС в течение ночи, и образец вращали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Затем образец подвергли диализу с помощью Tris (рН 7,6) перед очисткой на аффинной колонке Sepharose 4B-fetuin. Пик ФГА элюировали 0,05 М глициновым буфером, а затем проводили диализ фракции ФГА по отношению к воде перед сушкой вымораживанием.

Инсулиновая проба.

Концентрации иммунореактивного инсулина плазмы измеряли с использованием методики двойного осаждения антител (MacRae et al., 1991) и стандартного крысиного инсулина (Incstar Corporation, Stillwater, Min. USA). Меченный I125 бычий инсулин, 5 мк Ci/0,1 мкг (ref. IM 38) получали от Amersham International pie (Amersham, Buchs.), а антисыворотку к свиному инсулину, полученную у морских свинок - от Miles Scientific (Stoke Poges, Slough). Антисыворотку морских свинок IgG и нормальную сыворотку морских свинок получали от Scottish Antibody Production Unit (Law Hospital, Carluke, Lanarkshire).

Плазменная глюкоза.

Концентрацию глюкозы в образцах плазмы определяли с помощью автоанализаторного способа Триндера (1967).

Получение антител.

Антитела к KTI, BBI, LA вырабатывали у кроликов по методике Harboe and Inglid (1973), как описано ранее (Hajos et al., 1995). Антитела к SBA получали от Sigma Chemical Co (UK Ltd).

Сравнительный непрямой иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA).

Пробы для непрямого анализа ELISA были использованы для количественного определения SBA в образцах из кишечника (Hajos et al., 1995). Однако в случае LA пластинки ELISA были покрыты LA, а иммунокомплекс формировали путем использования анти-LA антител кролика IgG-типа. Результаты представлены в виде процентного количества выделенного материала по отношению к дозе, введенной в желудок.

Электрофорезное разделение питательных веществ в кишечных пробах.

Гель-электрофорез SDS с последующим полусухим перенесением на нитроцеллюлозные мембраны и иммунопропитка антигенспецифичными по отношению к антипитательным веществам антителами проводили так же, как и ранее (Hajos et al., 1995).

Составы экспериментальных диет (таблицы 1, 2, 3).

Введение 5-ФУ.

В 14 мл дистиллированной воды перемешивали 300 мг 5-фторурацила. Медленно добавили 1 М NaOH до растворения 5-ФУ. Общий объем раствора довели до 20 мл. Общий рН раствора составил 8,3. Дозу 150 мг/кг массы тела ввели в животное путем внутриперитонитной инъекции. Сразу же после инъекции крысам давали 15 г контрольной диеты и пищу в неограниченном 20 количестве на оставшееся время опыта.

Источник облучения.

Кобальтовая пушка Со60, общая доза 6,75 Грэй (Gy), полная экспозиция тела, скорость облучения 0,3 Грэй/мин.

Пример 1.

Три независимых опыта (1а, b, с) проводили по одной и той же схеме. Крысы 19-дневного возраста находились на стандартной диете 11 дней, а затем на LA-диете 3 дня (табл. 1) до достижения исходной массы 82-84 г. Затем крыс отбирали в группы по 5 крыс в соответствии с массой тела, и в каждой группе случайным образом выбирали для воздействия. Крыс каждой группы кормили ежедневно по утрам 6 г диеты: контрольной, LA-диетой или диетами на основе LA-диеты с различными уровнями добавок ФГА, так что их ежедневный прием ФГА составлял от 0,65 до 42 мг/1 крысу (от 0,007 до 0,45 г/кг массы тела). Через 10 дней крысам дали 2 г соответствующей диеты утром и умертвили их ровно через 2 часа. Икроножные мышцы были удалены, промыты, тушки и мышцы высушили вымораживанием и взвесили, В опыте 1 тушки были измельчены в порошок и экстрагированы смесью хлороформа и метанола (2:1 об.) для определения липидов.

Средняя масса тела для контрольных групп в опытах 1а, b, с была очень близка и составляла от 23,2 до 24 г. Кормление крыс диетами, содержащими ФГА в диапазоне от 0 до 42 мг на крысу в день (от 0 до 0,45 г/кг массы тела) снижало массу тела двояким образом. Наблюдалось небольшое снижение массы тела даже при низких уровнях ФГА (например, 4% при 3,5 мг/крысу в день, 0,4 г/кг массы тела), после чего относительно большое увеличение дозы пектина (примерно до 0,32 г/кг) привело лишь к весьма скромному дальнейшему снижению массы тела. Таким образом, в среднем для всех опытов при дозах менее 10 мг ФГА /день (0,12 г/кг массы тела) среднее снижение массы тела составляло 1,14 (среднеквадратичное отклонение (с. о. ) 0,25) г по сравнению с контрольной (4,9% от контрольной массы тела). При ежедневной дозировке ФГА от 10 до 27 мг (от 0,12 до 0, 32 г/кг массы тела) снижение было более заметным. Соотношение между относительной массой сухой тушки (в виде доли от конкретной нулевой дозировки) ОМСТ, и дозой ФГА м мг/день из трех независимых опытов (опыты 1а, b, с) при ее величине менее 27 мг/день таково:

ОМСТ = 0,918 (с.о. 0,008) - 0,0334 (с.о. 0,0062) х log10 (доза ФГА/27) При дозе ФГА выше указанной: ОМСТ = 0,918 (с.о. 0,008) - 0,5138 (с.о. 0,0876) х log10 (доза ФГА/27) Изменения сухой массы икроножных (скелетных) мышц имели такую же тенденцию с увеличением приема лектина (табл.4, 5). Относительная потеря мышечной массы по сравнению с контрольными крысами составляла примерно в 1,5-2 раза больше соответствующей потери массы тела (табл.4, 5), но при ежедневных дозах менее 10 мг ФГА (0,12 г/кг массы тела) различия между относительной потерей массы тела и мышц были несущественны (р>0,05).

Аналогично уменьшению массы тела и мышц, при увеличении дозы ФГА в диете содержание липидов в теле крыс уменьшалось (табл.5, опыт 1с). Однако относительная потеря липидов превышала относительные потери массы тела и скелетных мышц, хотя отношение потерь оставалось примерно одинаковым для всех доз.

ФГА обычно считают пищевым ядом, поскольку крысы, которых кормили исключительно белками фасоли, содержавшими большие количества ФГА (0,8-1,0 г/кг массы тела) погибали в течение нескольких дней (Pusztai, 1991). Однако поскольку ФГА не оказывает вреда на крыс, лишенных микрофлоры, его токсическое воздействие на крыс с обычной микрофлорой, по-видимому, является следствием чрезмерного роста E. coli в просвете тонкой кишки, малозаметного при дозах ниже 0,2 г/кг, но резко возрастающего пропорционально возрастанию уровня ФГА в диете (Pusztai et al., 1993). В примере 1 показано, что при уровне концентрации, не приводящем к чрезмерному росту бактерий (т.е. менее 0,2 г/кг) антипитательные эффекты ФГА для крыс с обычной микрофлорой малы, поскольку снижение массы тела после 10-дневного воздействия лектина минимально. Кроме того, в отличие от атрофии мышц, наблюдаемой при высоких дозах (0,45 г/кг и выше), уменьшение массы скелетных мышц при дозах ФГА менее 0,10 г/кг массы тела было небольшим и пропорциональным итоговой потере массы тела (табл.4, 5). Однако относительная потеря липидов по отношению к контрольной группе была выше, чем относительная потеря мышечной ткани, хотя соотношение между этими величинами оставалось примерно одинаковым (табл.4, 5). Таким образом, первым эффектом лектина является стимулирование ускорения липидного обмена в организме и, соответственно, низкая доза лектина может быть подходящим лекарством при нарушении обмена веществ, например ожирении.

Пример 2.

В примерах 2-5 испытывали инсулиновую реакцию крыс на ФГА. В примере 2 крысам давали диету, содержащую 42 мг ФГА/день, и уровень инсулина в крови измеряли через 9 и 10 дней, соответственно. Поодиночно размещенным 19-дневным самцам крыс Hooded Lister (не содержащим специфических патогенов) давали исходную диету (Special Diet Services, Manea, Cambridgeshire) примерно в течение 14 дней без ограничений, а затем при ограничении питания (8 г/крысу в день) в течение 5 дней контрольной диетой на основе лактальбумина (LA, табл. 1). Крыс кормили 3 раза в день: 2,5 г в 900 утра, 1,0 г в 1300 и 4,5 г в 1800. На пятый день крысам давали 1,5 г LA-диеты между 900 и 930 утра, и спустя 2 часа брали предварительные анализы крови из хвостовой вены. Кровь отбирали в гепаринизированные трубки (25 мкл раствора гепарина, содержащего 26 USP единиц в трубке) и центрифугировали в лабораторной центрифуге при +1oС в течение 15 мин. Для улучшения отделения плазмы от эритроцитов использовали пластмассовые гранулы, плазму разделили на аликвоты по 100 мкл и хранили до проведения анализа при -20oС. Затем крыс случайным образом разделили на 2 группы по 13 животных и размещали поодиночке. Группе 1 давали исключительно диету, содержащую фасоль (КВ-диета, табл.1) в течение 10